靶向代謝組學(xué)和脂質(zhì)組學(xué)是針對特定類別的代謝物或脂質(zhì)分子進(jìn)行精確定量分析的強(qiáng)大工具。盡管兩者在樣本前處理上略有差異，但核心分析流程高度相似，主要可分為四個(gè)關(guān)鍵步驟。

?? 一、樣本采集與保存

這是確保數(shù)據(jù)質(zhì)量的第1步，關(guān)鍵在于迅速“凍結(jié)”生物體的代謝狀態(tài)，防止目標(biāo)分子降解。

通用原則：

快速處理：樣本采集后應(yīng)立即處理，以淬滅酶活性。

低溫保存：通常使用液氮速凍，然后轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱長期保存。

避免反復(fù)凍融：建議將樣本分裝保存，以減少因反復(fù)凍融造成的代謝物損失或降解。

具體類型：

血液樣本（血清/血漿）：采血時(shí)需選擇合適的抗凝劑（如EDTA），并避免溶血。血清需靜置凝固后離心取上清；血漿則直接離心。

組織樣本：取樣后迅速用液氮冷凍，研磨成粉末后再進(jìn)行提取。

細(xì)胞樣本：需用預(yù)冷的PBS清洗，然后通過液氮反復(fù)凍融或使用溶劑混合液進(jìn)行細(xì)胞破碎和代謝物提取。

尿液樣本：通常需要離心去除雜質(zhì)，可直接稀釋后進(jìn)樣，或采用與血液樣本類似的蛋白沉淀法處理。

?? 二、樣本前處理

此步驟旨在從復(fù)雜的生物基質(zhì)中提取出目標(biāo)分析物，并去除蛋白質(zhì)、鹽類等干擾物質(zhì)。

靶向代謝組學(xué)：

核心方法：蛋白沉淀。

常用試劑：多采用甲醇、乙腈或其與水按一定比例（如1:1）混合的有機(jī)溶劑。

操作流程：向樣本中加入預(yù)冷的有機(jī)溶劑，渦旋混勻，冰浴或低溫放置一段時(shí)間使蛋白質(zhì)充分沉淀，然后高速離心，取上清液。若濃度過低，可將上清液真空冷凍干燥或氮?dú)獯蹈珊?，再用合適的溶劑復(fù)溶定容。

靶向脂質(zhì)組學(xué)：

核心方法：液-液萃取。

常用體系：經(jīng)典的氯仿-甲醇體系（如Folch法、Bligh & Dyer法）或甲基叔丁基醚（MTBE）-甲醇體系。

操作流程：利用不同溶劑對脂質(zhì)的溶解度差異，將脂質(zhì)從水相中萃取到有機(jī)相。離心后會(huì)形成分層，收集含有脂質(zhì)的下層（氯仿法）或上層（MTBE法）有機(jī)相，隨后蒸發(fā)干燥并用特定的復(fù)溶液（如異丙醇/甲醇）重懸，供儀器分析。

?? 三、儀器檢測與數(shù)據(jù)采集

這是整個(gè)流程的核心，通過高靈敏度的儀器對目標(biāo)分子進(jìn)行分離、定性和定量。

?? 四、數(shù)據(jù)分析與解讀

將儀器產(chǎn)生的原始信號(hào)轉(zhuǎn)化為有生物學(xué)意義的結(jié)論。

數(shù)據(jù)處理：使用專業(yè)軟件（如Analyst, MultiQuant等）對MRM色譜峰進(jìn)行積分，得到每個(gè)目標(biāo)物的峰面積或峰高。

定量處理：通過建立已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品曲線，并結(jié)合內(nèi)標(biāo)法（通常使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的內(nèi)標(biāo)物）校正提取效率和基質(zhì)效應(yīng)，最終計(jì)算出樣本中每種目標(biāo)代謝物或脂質(zhì)的精確濃度。

統(tǒng)計(jì)分析：運(yùn)用t檢驗(yàn)、方差分析（ANOVA）、主成分分析（PCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）等方法，比較不同實(shí)驗(yàn)組間的差異，篩選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異分子。

通路富集分析：將篩選出的差異分子映射到KEGG等代謝通路數(shù)據(jù)庫中，揭示其參與的生物學(xué)通路變化，從而闡釋潛在的分子機(jī)制。